Western Blot除了能證明某樣品中含有某種蛋白之外，其最為重要的作用是比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少——即為蛋白表達水平最直接的證據(jù)。要衡量蛋白的表達水平，前提條件就是等量的上樣量。內(nèi)參的意義就是保證上樣量的一致。
內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。
選擇內(nèi)參抗體應遵循的原則
1、樣本來源
?哺乳動物的組織或細胞：β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等；
?植物樣本：plant actin、Rubisco 等；
?其他來源樣本，應參照已發(fā)表文獻,選擇合適蛋白作為內(nèi)參。
2、目的蛋白定位?全細胞蛋白和細胞質：β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；
?細胞核蛋白：PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3，K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等；
?胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等；
?線粒體蛋白：VDAC1、COXIV等；
?血清：Transferrin等。
3、目的蛋白分子量目的蛋白分子量最好能與內(nèi)參蛋白分子量相差 5kd 以上，各內(nèi)參蛋白分子量詳見下方匯總表。
Tips: 內(nèi)參的選擇還需要考慮實際的試驗環(huán)境：
★在做多組織多細胞樣本對比表達量時，最好選用 GAPDH作為內(nèi)參，因為GAPDH是代謝類蛋白，在活組織中表達比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結構蛋白，不同組織的細胞結構會有差異性；
★而在某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內(nèi)參；
★涉及細胞增殖的相關試驗中，c-Jun由于自身表達變化不適合做內(nèi)參；
★凋亡實驗時，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參；
★做誘導后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時，應選擇結構蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin 和β-Tubulin。
★做各種分泌液樣本的時候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒有完整的細胞結構，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。
※ 設計實驗方案的時候應該考慮實際的實驗因素并查詢相應文獻，在實驗過程中也應該注意內(nèi)參表達是否出現(xiàn)異常。
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